基礎(chǔ)篇
一、如何選擇試劑，評(píng)價(jià)試劑是否符合自己實(shí)驗(yàn)室條件？
現(xiàn)在臨床PCR實(shí)驗(yàn)室使用的試劑大部分都是各生產(chǎn)企業(yè)提供的商品化的試劑盒，那么試劑質(zhì)量的好壞直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞，而不同廠家試劑的性能、質(zhì)量和價(jià)格千差萬別，如何選擇一款合適的試劑對(duì)每個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室都至關(guān)重要，一般來說，選擇試劑主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)：
1、重復(fù)性 首先，試劑檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性直接展現(xiàn)了試劑的方法學(xué)及其質(zhì)量的好壞，是評(píng)價(jià)試劑好壞最明顯、最直接的指標(biāo)。 其次，我們?cè)诖苏f的試劑重復(fù)性是指對(duì)原始樣本檢測(cè)的重復(fù)性，而不是對(duì)某一個(gè)樣本提取的核酸進(jìn)行重復(fù)性的檢測(cè)和評(píng)價(jià)。 最后，試劑的重復(fù)性對(duì)于療效檢測(cè)、用藥指導(dǎo)有著重大的意義，一個(gè)重復(fù)性好的試劑，往往能夠在病人的抗病毒治療過程中，給醫(yī)生和病人提供最直接、最可靠的數(shù)據(jù)，讓醫(yī)生和病人對(duì)疾病進(jìn)展有更清楚的認(rèn)識(shí)，從而制定合理的治療方案，實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。
2、靈敏度 一個(gè)試劑的靈敏度往往能夠體現(xiàn)該試劑的技術(shù)水平和先進(jìn)程度，同時(shí)對(duì)于臨床病癥的監(jiān)測(cè)有著舉足輕重的意義。以乙肝為例來說，我國的乙肝復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于發(fā)達(dá)國家，同時(shí)由乙肝病毒感染轉(zhuǎn)換為慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，這很大程度上與對(duì)低載量病毒監(jiān)控的嚴(yán)重不足有關(guān)。美國肝病學(xué)會(huì)專家組就提出，對(duì)乙肝抗病毒治療過程中，HBV DNA的最低監(jiān)測(cè)點(diǎn)應(yīng)設(shè)置為10IU/ml，而歐洲和亞太肝病學(xué)也指出HBV DNA病毒載量應(yīng)該盡可能小于10IU/ml。這都足以證明，高靈敏度對(duì)于用藥治療、病程監(jiān)控等起著巨大的作用，靈敏度越高，對(duì)于疾病的監(jiān)控效果更好，對(duì)于確定治療的終點(diǎn)，具有積極的指導(dǎo)作用。
3、定量準(zhǔn)確性 對(duì)于臨床檢測(cè)中定量項(xiàng)目來說，試劑盒定量的準(zhǔn)確性是非常重要的，也是評(píng)價(jià)定量試劑盒的一個(gè)重要指標(biāo)之一。衛(wèi)生部每年都會(huì)有2次全國性的室間質(zhì)評(píng)，通過質(zhì)評(píng)結(jié)果可以很好的看出試劑盒定量的準(zhǔn)確性。 但往往很多時(shí)候，實(shí)驗(yàn)室在選擇試劑的時(shí)候都偏重與過去的試劑盒比較定量結(jié)果的差異，并以過去的試劑盒定值作為標(biāo)準(zhǔn)來參考和評(píng)價(jià)一種新試劑，其實(shí)這種方法不完全可取。不過可以通過同時(shí)檢測(cè)衛(wèi)生部的質(zhì)控品來進(jìn)行比較，這樣才使得兩種試劑在同一客觀標(biāo)準(zhǔn)上進(jìn)行PK，得到合理公平的評(píng)價(jià)。 同時(shí)，要驗(yàn)證一個(gè)試劑的定量是否準(zhǔn)確，我們可以采用一個(gè)高濃度樣本，用陰性血清依次進(jìn)行10倍梯度的稀釋，然后選取多家試劑公司的產(chǎn)品進(jìn)行同步檢測(cè)PK，考察各公司試劑對(duì)樣本定值的實(shí)際值與理論值的差異，即可判斷各公司試劑定量準(zhǔn)確與否。
4、有無內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè) 內(nèi)標(biāo)的一個(gè)最主要的作用就是控制假陰性結(jié)果的發(fā)生，但在國內(nèi)臨床檢測(cè)中往往被忽視了，這主要與兩個(gè)方面有關(guān)，一個(gè)是之前國內(nèi)使用的很多熒光定量PCR儀均為單通道的儀器，無法進(jìn)行多色熒光的檢測(cè)；國內(nèi)外PCR行業(yè)對(duì)內(nèi)標(biāo)的研究已不是一個(gè)新興課題，目前國內(nèi)PCR行業(yè)能把內(nèi)標(biāo)做得非常好的科研單位或商業(yè)化的PCR試劑廠家寥寥無幾，這正體現(xiàn)了這一技術(shù)的難度。 在臨床檢測(cè)中，內(nèi)標(biāo)的作用非常重要。在臨床檢測(cè)過程中，怎么做到每一個(gè)陰性結(jié)果均為真正的陰性結(jié)果，從而杜絕因擴(kuò)增抑制而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果呢？?jī)?nèi)標(biāo)的加入就能夠很好的防止假陰性結(jié)果了，加入我們做了一個(gè)樣本，它的目標(biāo)檢測(cè)熒光為陰性，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)熒光也為陰性，那么這個(gè)樣本的擴(kuò)增則受到了抑制，該陰性結(jié)果為假陰性，我們必須對(duì)該樣本進(jìn)行復(fù)檢。如果試劑沒有內(nèi)標(biāo)的話，我們則不能很好的判斷該結(jié)果是否正常？是否可以發(fā)報(bào)告？在發(fā)報(bào)告時(shí)，我們無法保證發(fā)出去的結(jié)果百分之百的準(zhǔn)確；內(nèi)標(biāo)的加入，就可以解決我們這方面的煩惱。目前，衛(wèi)生部的專家也在大力推崇內(nèi)標(biāo)的重要性，也是為了保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。
5、線性定量范圍 試劑盒的線性定量范圍指的是試劑盒最低檢測(cè)下限和最高檢測(cè)上限之間的范圍，范圍越寬說明試劑盒性能越好。
6、UNG酶防污染體系 PCR反應(yīng)過程中， 1個(gè)拷貝的DNA經(jīng)過30個(gè)循環(huán)后，可以增長(zhǎng)到10億個(gè)拷貝的產(chǎn)物DNA， 極微量的PCR 產(chǎn)物污染，就可能造成假陽性，因而這是一個(gè)值得特別重視的問題。 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：將PCR 產(chǎn)物中的dT用dU 代替。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG 對(duì)不含dU 的模板無任何影響，UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對(duì)RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。 此外，試劑的穩(wěn)定性、批間差、溯源性（是否溯源于WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品）等也都是考察一款試劑盒質(zhì)量重要指標(biāo)。
二、如何選擇熒光定量PCR儀器？
1、儀器使用的廣泛程度 如果不是一個(gè)新出現(xiàn)的儀器品牌，為保證所購置的儀器有充分的可靠性，臨床PCR實(shí)驗(yàn)室可以從相應(yīng)儀器在國內(nèi)外使用的廣泛程度來判斷。應(yīng)用越是廣泛的儀器，越是經(jīng)過實(shí)踐驗(yàn)證的，也就越具有可靠性。
2、儀器的檢測(cè)通量（反應(yīng)孔數(shù)） 在購買定量PCR儀的時(shí)候需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的要求來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR儀的檢測(cè)通量小到16多到384孔，實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的檢測(cè)項(xiàng)目和發(fā)展?fàn)顩r，選擇合適的儀器，沒必要追求最昂貴的儀器，一般來說，96孔的通量足夠用了；如需尋找新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記等類型的實(shí)驗(yàn)，則可以考慮購買384孔的儀器。
3、儀器的通道數(shù)量 隨著醫(yī)院開展的項(xiàng)目越來越多，比如基因表達(dá)，單核苷酸多態(tài)性分析、高分辨率熔解曲線等，那么單通道的儀器則無法滿足實(shí)驗(yàn)室的需求了，而多通道的設(shè)計(jì)則能使其更方便地檢測(cè)多重PCR檢測(cè)及其衍生的基因表達(dá)等其他分析模式。
4、耗材的開放性 耗材如擴(kuò)增反應(yīng)管的開放性可能會(huì)決定日常檢測(cè)成本的高低。作為臨床PCR實(shí)驗(yàn)室，在選擇實(shí)時(shí)熒光PCR儀時(shí)，可考慮這一點(diǎn)。不過對(duì)于檢測(cè)HCV等RNA項(xiàng)目的時(shí)候，盡量使用去RNAnase酶耗材。
5、硬件設(shè)計(jì)特點(diǎn) 熒光定量PCR儀主要有96孔板式和離心式等，每種設(shè)計(jì)都有它的獨(dú)到之處，但也都有無法避免的缺陷。 96孔板的熒光定量PCR儀可以容納的樣本量大，最大可至100ul，而且無需特殊的耗材。傳統(tǒng)的96孔板儀器多采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)在于：鹵鎢燈的光強(qiáng)比LED燈強(qiáng)，波長(zhǎng)范圍廣，對(duì)于熒光染料的激發(fā)具有非常好的效果，性能比較穩(wěn)定，使用壽命約3000個(gè)小時(shí)左右；但CCD的檢測(cè)通常會(huì)因?yàn)槊總€(gè)樣品孔距光源和檢測(cè)器的光程各不相同，會(huì)產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。為了保證精確、精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這類儀器在實(shí)驗(yàn)過程中通常需要配合ROX校正染料，來平衡孔間差異； 離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測(cè)，設(shè)計(jì)上避免了邊緣效應(yīng)，同時(shí)PMT檢測(cè)對(duì)熒光信號(hào)可以放大或縮小，相對(duì)于CCD檢測(cè)更加靈活，靈敏度更高；但LED的熒光強(qiáng)度比較弱，波長(zhǎng)范圍也比較窄，因此，對(duì)熒光染料的激發(fā)效果不如鹵鎢燈；
6、運(yùn)行速度 在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也是非常重要的。更快的升降溫，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合和反應(yīng)時(shí)間，提高PCR的特異性。但是，運(yùn)行速度越快，對(duì)加熱制冷模塊的要求越高，因此，穩(wěn)定性是其存在的最大問題，如果在市面上經(jīng)過長(zhǎng)期考證的，穩(wěn)定性好的儀器，運(yùn)行速度越快，帶來的便捷越多；
7、靈活性 在儀器基本性能得到保證的情況下，另外一方面則需要考慮儀器的靈活性，主要包括：儀器運(yùn)輸?shù)撵`活性，拆卸的靈活性，軟件升級(jí)的靈活性，模塊更換的靈活性以及使用的靈活性等。
三、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室硬件基本要求是什么？
（1）實(shí)驗(yàn)室整體布局： 根據(jù)衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)）要求，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴(kuò)增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)，也可以將后兩個(gè)區(qū)域合為一個(gè)區(qū)，即擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)時(shí)按照《辦法》規(guī)定，三個(gè)區(qū)域相互獨(dú)立，并有各自的緩沖區(qū)域。
（2）各工作區(qū)域儀器設(shè)備 各工作區(qū)域的儀器設(shè)備及物品，包括椅子、辦公用品、清潔用品等均不能拿出本區(qū)域，所有可移動(dòng)物品均應(yīng)有本區(qū)域的標(biāo)示。 各區(qū)域應(yīng)具備的設(shè)備配置為：屋頂紫外燈、近臺(tái)紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、廢液缸、掃帚、拖把、廢紙簍、微量加樣器（覆蓋1-1000ul），經(jīng)高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）、筆、紙等。
各工作區(qū)域的特殊配置包括：
（1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)：2～8℃冰箱、漩渦震蕩器、超凈工作臺(tái)。
（2）標(biāo)本制備：2～8℃冰箱、-20℃冰箱、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、漩渦震蕩器、金屬加熱模塊、超凈工作臺(tái)。
（3）擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)：熒光定量核酸擴(kuò)增儀、電腦、打印機(jī)。 同時(shí)：進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一流向，并用明顯的箭頭表示，各區(qū)域用不同的顏色以示區(qū)別。即試劑貯存和設(shè)備區(qū)（藍(lán)色）→標(biāo)本制備區(qū)（白色）→擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)（粉色）。
四、如何分析室內(nèi)質(zhì)控品的結(jié)果？
采用Levey-Jerming質(zhì)控圖, 以X±2SD警告線，X±3SD為失控線。質(zhì)控點(diǎn)落在x±3S之外時(shí)，首先采取的措施是復(fù)檢，復(fù)檢的目的主要是用于查明人為誤差，也可以查出偶然誤差，如果是偶然誤差，重測(cè)的結(jié)果應(yīng)在允許范圍內(nèi)。同時(shí)還在觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成情況，擴(kuò)增效率的高低，曲線梯并是否良好，曲線形態(tài)是否標(biāo)準(zhǔn)，Ct值是否有飄移，還要結(jié)合臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，是否有高值和低值，來區(qū)分是試劑造成的失控還是操作不當(dāng)、儀器故障或老化造成的失控。若臨床標(biāo)本測(cè)定結(jié)果的曲線標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量值有高有低，同時(shí)檢測(cè)的試劑空白及陰性質(zhì)控均在控，很有可能是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量有問題，如降解、更換試劑型號(hào)等情況發(fā)生造成的。 對(duì)于連續(xù)7個(gè)質(zhì)控點(diǎn)落在均值之一側(cè)，若均未超出X±3s范圍時(shí)，認(rèn)為存在系統(tǒng)誤差，但檢測(cè)結(jié)果仍可發(fā)出；若連續(xù)7個(gè)質(zhì)控點(diǎn)落在均值之一側(cè)，而且質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)有超出X±3s范圍的趨勢(shì)時(shí)(逐漸升高或逐漸降低)，一定要聯(lián)絡(luò)儀器工程師，及時(shí)校準(zhǔn)儀器。
五、內(nèi)標(biāo)定量與外標(biāo)定量對(duì)比？
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 內(nèi)標(biāo)定量：若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，他們之間存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)，也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。 外標(biāo)定量：外標(biāo)法不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中，而是與被測(cè)樣品在相同條件下進(jìn)行檢測(cè)。由于在熒光定量PCR中，Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，因此可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，并且在PCR循環(huán)剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的，因此定量的結(jié)果也會(huì)準(zhǔn)確很多。 美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法?！綤e LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】
六、IU/ml和copies/ml之間單位換算關(guān)系？ 首先簡(jiǎn)單來說，IU/ml和copies/ml是沒有直接關(guān)系的，IU/ml是國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的表述單位，copies/ml是各檢測(cè)方法對(duì)結(jié)果的表述單位的一種，可參見李金明《實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)》P177。 所謂的International Unit（IU），是為了統(tǒng)一各個(gè)檢測(cè)方法而設(shè)定的單位。本身PCR檢測(cè)的拷貝數(shù)是無法絕對(duì)定量的，可以理解為，為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，WHO制定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，賦予其IU值，發(fā)放給各個(gè)PCR試劑廠商，讓他們把各自檢測(cè)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，從而得出各自的換算系數(shù)。比如分發(fā)的是1IU的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，羅氏測(cè)的是2copy，那羅氏的換算系數(shù)是2（2copies=1 IU），雅培的是20copy,那雅培的就是20（20copies=1 IU），由此可見，各個(gè)方法的轉(zhuǎn)換系數(shù)是不一樣的。 其次，因?yàn)楦鲗?shí)驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果的表述單位存在多樣化，如copies/ml，geq/ml等，使得檢測(cè)結(jié)果沒有可比性，因而WHO應(yīng)用國際單位IU作為統(tǒng)一的表述單位，使不同實(shí)驗(yàn)室、不同檢測(cè)方法得出的檢測(cè)結(jié)果的表述單位得到統(tǒng)一并具有了可比性。 最后，具體每種方法的檢測(cè)結(jié)果與IU的關(guān)系，可以通過同時(shí)檢測(cè)WHO的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后根據(jù)其與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比例關(guān)系，來找到不同檢測(cè)方法IU與copies之間的關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)篇
一、“假陰性”與“假陽性”結(jié)果如何判定？
假陰性判斷：造成假陰性結(jié)果的原因有很多，主要體現(xiàn)在FAM擴(kuò)增曲線不起來，原因包括標(biāo)本抑制，核酸提取失敗，基因突變以及儀器故障等。 目前國內(nèi)主流PCR試劑都不帶內(nèi)標(biāo)監(jiān)控功能，用于檢測(cè)目標(biāo)基因的FAM擴(kuò)增曲線既用來定量又用于定性（判斷陰陽性），因此FAM擴(kuò)增曲線的好壞非常關(guān)鍵。對(duì)于此類無內(nèi)標(biāo)試劑，建議結(jié)合乙肝血清標(biāo)志物結(jié)果（五項(xiàng)定量/定性結(jié)果）來判斷陰陽性，即使是FAM曲線有擴(kuò)增也應(yīng)該參考此結(jié)果，特別是E抗原結(jié)果。同時(shí)，對(duì)于擁有競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)監(jiān)控功能的試劑來說，可有以下四種情況發(fā)生：如FAM無擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)有擴(kuò)增：結(jié)果正常，判斷該樣本為陰性結(jié)果；如FAM無擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)也無擴(kuò)增：結(jié)果異常，可能原因核酸提取失敗或有抑制，一定要重復(fù)實(shí)驗(yàn)；如FAM有擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)有擴(kuò)增：結(jié)果正常，因?yàn)榇郎y(cè)核酸和內(nèi)標(biāo)在同一反應(yīng)體系下擴(kuò)增；如FAM有擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)無擴(kuò)增：結(jié)果正常，強(qiáng)陽性樣本會(huì)抑制內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增，導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)結(jié)果偏弱或陰性。 假陽性判斷（如何判定）：臨床PCR檢測(cè)當(dāng)中造成假陽性結(jié)果的情況比較少，原因包括試劑污染，氣溶膠污染，操作污染，擴(kuò)增產(chǎn)物污染，非特異性擴(kuò)增，耗材污染等，所以建議一定要做陰性對(duì)照來監(jiān)控是否存在污染。
二、造成陽性樣本漏檢的可能原因有哪些？
在臨床PCR檢測(cè)中，造成陽性樣本漏檢的原因很多，其中包括實(shí)驗(yàn)操作原因，試劑盒本身的原因，樣本原因等等。
第一：在實(shí)驗(yàn)操作過程中，核酸提取丟失或失敗而導(dǎo)致漏檢是比較常見的原因之一，如煮沸法試劑，要經(jīng)過高速離心、吸去上清及高溫煮沸等過程，很容易造成核酸的丟失，對(duì)于一些弱陽性樣本，很可能因核酸丟失造成漏檢；
第二：由于試劑盒本身設(shè)計(jì)的缺陷，而導(dǎo)致對(duì)某種少見基因型檢測(cè)不出來情況，這是試劑盒設(shè)計(jì)的硬傷，因此檢驗(yàn)者必須根據(jù)具體情況來選擇合適的試劑進(jìn)行檢測(cè)；
第三：操作過程中，因操作不規(guī)范，帶入一些外源性抑制物，而最終導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增受抑制?？梢娫噭┖蟹椒▽W(xué)特點(diǎn)以及去抑制物能力對(duì)臨床檢驗(yàn)的重要性。另外，一些外源性抑制物也有可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，比如手套的滑石粉，因此建議使用無粉手套，同時(shí)也要求操作者嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作。
三、PCR擴(kuò)增曲線中，造成不規(guī)則擴(kuò)增曲線的可能原因有哪些？ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線包括基線期，指數(shù)擴(kuò)增期，線性擴(kuò)增期和擴(kuò)增平臺(tái)期，標(biāo)準(zhǔn)的曲線應(yīng)該呈典型的S型。 不規(guī)則曲線可以根據(jù)曲線的具體情況來分析：
1）曲線呈斜線上升 原因：熱蓋失靈或熱蓋沒蓋緊，導(dǎo)致控溫不準(zhǔn)、液體揮發(fā)。 解決辦法:更換儀器熱蓋或?qū)嵘w蓋緊。
2）擴(kuò)增曲線分成兩段（斷裂）
原因：基線的終點(diǎn)大于Ct值，通常是因?yàn)槟０錎NA濃度偏高，CT值< 15，而基線仍然取3-15，其中包含部分?jǐn)U增信號(hào)，導(dǎo)致曲線被壓下去。 解決方法：減小基線終點(diǎn)，至Ct值前4個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。
3）直線擴(kuò)增曲線 圖3 某些樣本出現(xiàn)直線擴(kuò)增曲線 原因：探針部分降解 解決辦法:建議更換試劑進(jìn)行測(cè)試。
4）曲線平臺(tái)期下掉 原因：蓋子沒蓋緊 解決辦法:PCR反應(yīng)管蓋子蓋上后，檢查蓋子是否蓋緊。 圖4 曲線平臺(tái)期下掉
四、乙肝兩對(duì)半的大三陽標(biāo)本HBV DNA檢不出怎么辦？
HBV-DNA檢查是反應(yīng)乙肝病毒復(fù)制程度和傳染性大小的最直接指標(biāo)。臨床數(shù)據(jù)顯示，在乙肝兩對(duì)半大三陽病例 中，HBV DNA陽性的檢出率極高，但HBV DNA陰性的結(jié)果也是很有可能的。一般乙肝大三陽HBV-DNA陰性雖然表明患者病毒未超標(biāo)，但大三陽結(jié)果提示患者感染乙肝病毒，且具有較強(qiáng)傳染性。盡管如此，臨床檢驗(yàn)者也可能遇到大三陽標(biāo)本HBV DNA檢測(cè)不出的情況。首先對(duì)于這樣的標(biāo)本，可以將標(biāo)本進(jìn)行稀釋后進(jìn)行復(fù)查，排除血清或血漿標(biāo)本中存在抑制物或者陽性標(biāo)本HBV DNA濃度超過試劑盒上限而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗的情況。其次，乙肝病毒發(fā)生變異也是導(dǎo)致PCR擴(kuò)增不出的原因之一，通常都是用藥治療患者的乙肝病毒核酸序列發(fā)生了突變。如經(jīng)過多種PCR試劑檢測(cè)失敗后，可進(jìn)行DNA測(cè)序以確定乙肝病毒及其變異位點(diǎn)，以指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥治療。最后， 可更換另一廠家試劑進(jìn)行檢測(cè)，排除原試劑本身設(shè)計(jì)缺陷而造成漏檢的情況。
五、乙肝兩對(duì)半全陰的標(biāo)本HBV DNA結(jié)果呈陽性怎么辦？
國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，乙肝兩對(duì)半標(biāo)志物全陰性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因?yàn)镠BV DNA的檢測(cè)窗口期出現(xiàn)早于乙肝血清標(biāo)志物，因此此類患者可能處于乙肝感染早期。 乙肝感染后，在乙肝“兩對(duì)半”檢測(cè)中，表面抗原HBsAg出現(xiàn)最早，一般在感染3周后出現(xiàn)，而HBV DNA的檢測(cè)能將窗口期縮短至6-15天，乙肝兩對(duì)半全陰的標(biāo)本HBV DNA為陽性，是因?yàn)椴∪颂幱诟腥疽腋尾《镜某跗?，免疫學(xué)的檢測(cè)窗口期比基因檢測(cè)的窗口期長(zhǎng)，導(dǎo)致兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果為陰性，由此可知：HBV DNA的檢測(cè)，對(duì)于疾病的早期診斷有著非常重要的意義。
六、怎樣保證實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)質(zhì)量？
1）為了保證檢測(cè)質(zhì)量，臨床PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理的空間，良好的照明和空調(diào)設(shè)備。工作環(huán)境雖不是檢測(cè)質(zhì)量的直接原因，但寬敞舒適的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境將肯定有利于檢驗(yàn)質(zhì)量的保證。
2）合理有效地對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行管理，定期做維護(hù)和校準(zhǔn)，使其處于一個(gè)良好的狀態(tài)。例如，定期校準(zhǔn)移液器，使其保持足夠的準(zhǔn)確度和精密度。定期維護(hù)熒光定量PCR儀的光學(xué)系統(tǒng)和反應(yīng)孔間溫度差異，使其保持在良好狀態(tài)和允許的范圍內(nèi)。此外，還包括天平，離心機(jī)，冰箱等設(shè)備的管理。
3）理想的試劑：主要有內(nèi)外兩個(gè)因素，內(nèi)在因素包括標(biāo)本處理方法，用于核酸擴(kuò)增的原材料及方法學(xué)設(shè)計(jì)等。外出因素包括試劑盒的運(yùn)輸和保存中的問題。
4）標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：完整的臨床PCR程序由標(biāo)本采集，運(yùn)送，保存，編號(hào)，試劑準(zhǔn)備，核酸提取，擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)，結(jié)果分析和報(bào)告等諸多環(huán)節(jié)，建立科學(xué)和與本實(shí)驗(yàn)室配套的SOP文件，嚴(yán)格按SOP進(jìn)行操作。
5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有標(biāo)本中的大量待測(cè)微生物，克隆質(zhì)粒，大量存在實(shí)驗(yàn)室中的特定微生物以及以前擴(kuò)增產(chǎn)物的殘留污染等。這些都是實(shí)驗(yàn)室最容易造成假陽性的污染。因此，必須嚴(yán)格分區(qū)實(shí)驗(yàn)室及遵守工作流程，使用化學(xué)清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，使用紫外線照射和UNG方法消除擴(kuò)增產(chǎn)物污染等等。
6）進(jìn)行室內(nèi)和室間質(zhì)量控制，室內(nèi)質(zhì)量控制可以確保實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)測(cè)定質(zhì)量的一致性，室間質(zhì)量控制可以提供將實(shí)驗(yàn)室測(cè)定情況與一室間和客觀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回顧性比較的數(shù)據(jù)。
七、實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物污染怎么辦？
如實(shí)驗(yàn)室的擴(kuò)增產(chǎn)物泄露，造成實(shí)驗(yàn)室的污染，那么后果將非常嚴(yán)重。要去除污染，首先最重要的是保持通風(fēng)，保證擴(kuò)增產(chǎn)物片段能順利擴(kuò)散出去；其次可采用稀酸處理法，對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm，需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大；最后若污染長(zhǎng)時(shí)間不能消除，建議更換另外廠家的PCR試劑進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)槊總€(gè)廠家的引物設(shè)計(jì)區(qū)域不一樣；一般情況下，一家試劑公司的擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)在另外一家廠家的引物設(shè)計(jì)區(qū)域內(nèi)，因此不會(huì)造成產(chǎn)物污染的假陽性。
儀器篇
一、如何判斷自己的PCR儀器熒光檢測(cè)是否正常？
要判斷自己的PCR儀器是否正常，可從以下幾方面考慮：
1.儀器開關(guān)機(jī)，與軟件連接是否正常。
2.儀器運(yùn)行同樣的實(shí)驗(yàn)所需要的時(shí)間是否跟平時(shí)一致，由此判斷儀器的加熱制冷模塊是否正常。
3.曲線結(jié)果是否呈明顯的S型，若曲線異常，如呈曲折上升狀，則可能是熱蓋問題，或者是熒光檢測(cè)裝置出現(xiàn)問題。
4.若曲線的熒光值與平時(shí)相比，明顯降低，則要考慮是否需要更換儀器光源（尤其是鹵素?zé)?，其光源壽命約2000h）。
5.若儀器某一孔或幾孔的熒光值明顯高于其他孔位，則需要考慮儀器的孔槽或檢測(cè)光路是否受到熒光污染，建議清洗儀器孔槽后再進(jìn)行測(cè)試。
二、PCR儀器運(yùn)行中突然斷電怎么辦？
通常我們建議在實(shí)驗(yàn)室配備UPS電源，這樣能夠保證PCR儀器運(yùn)行過程中的正常供電，從而保證程序的正常運(yùn)行。PCR儀器在運(yùn)行中突然斷電的話，如儀器有斷電保護(hù)功能，則可直接繼續(xù)運(yùn)行程序。如實(shí)驗(yàn)室無UPS電源，突然斷電而導(dǎo)致PCR程序不能完成，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，建議只能重復(fù)實(shí)驗(yàn)再上機(jī)檢測(cè)。
三、PCR儀器的熱蓋壞了怎么辦？
熒光定量PCR儀的熱蓋失效或故障最主要的表現(xiàn)是：控溫不準(zhǔn)和液體揮發(fā)，反應(yīng)液揮發(fā)會(huì)最終導(dǎo)致曲線不擴(kuò)增，呈斜線上升。首先可通過曲線判斷熱蓋是否故障，若確定熱蓋已經(jīng)壞了，建議可以在每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入一層礦物油（礦物油可避免反應(yīng)液揮發(fā)），上機(jī)測(cè)試曲線結(jié)果是否正常。如曲線仍然異常，則建議請(qǐng)儀器工程師現(xiàn)場(chǎng)維修，甚至直接更換熱蓋。
四、PCR儀器有哪些常見的小問題？如何解決？
PCR儀器常見的小問題有如下幾點(diǎn)：
1.打開電源但是儀器不響應(yīng)。這種情況很可能是由于電源線脫落或者沒有插緊而致，將電源線重新插入插座即可排除故障。
2.儀器和軟件無法正常連接。建議打開儀器電源，讓儀器通過自檢后，再打開軟件；因?yàn)閮x器在自檢過程中，很容易導(dǎo)致軟件連接不上。另外，若儀器和軟件仍連接不上，檢查連接線是否插緊，再重啟軟件。
3.儀器加熱或冷卻速度緩慢。PCR反應(yīng)過程的關(guān)鍵是升、降溫過程的時(shí)間控制，要求越短越好，當(dāng)PCR儀的降溫過程超過60s，就應(yīng)該檢查儀器的制冷系統(tǒng)，對(duì)風(fēng)冷制冷的PCR儀要較徹底地清理反應(yīng)底座的灰塵；對(duì)其他制冷系統(tǒng)應(yīng)檢查相關(guān)的制冷部件，最好找儀器工程師進(jìn)行維護(hù)。
4.熱蓋控溫失靈。這種情況可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的曲線結(jié)果很亂，不呈S型，且運(yùn)行結(jié)束后，會(huì)發(fā)現(xiàn)PCR反應(yīng)管的側(cè)壁甚至頂部有很多液滴，這樣會(huì)導(dǎo)致熒光采集光路發(fā)生變化，曲線結(jié)果異常。
5.儀器加熱模塊的孔槽被污染，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)孔的熒光值很高。結(jié)果運(yùn)行完成后，發(fā)現(xiàn)某個(gè)孔位的熒光值本底明顯高于其他孔位，則要考慮該孔是否被污染，最好對(duì)儀器孔槽進(jìn)行清潔。先打開蓋子，然后用無水乙醇浸泡樣品池5min，然后用移液器吸去液體，再加入去離子水進(jìn)行二次清潔，用移液器吸去液體；打開PCR儀，設(shè)定保持溫度為50℃的PCR程序并使之運(yùn)行，讓殘余液體揮發(fā)去除，一般5～10min即可。
五、PCR反應(yīng)管上面做標(biāo)記對(duì)結(jié)果有何影響？
我們不建議在PCR反應(yīng)管上用記號(hào)筆做任何標(biāo)記。據(jù)李金明教授的《實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)》一書上的P100記載：反應(yīng)管用記號(hào)筆做標(biāo)記，加熱將使顏料揮發(fā)，進(jìn)而污染光路部分影響檢測(cè)。
六、PCR反應(yīng)管為什么不放在儀器孔槽的邊緣？
主要原因大致分為一下兩點(diǎn)：
①CCD檢測(cè)系統(tǒng)：對(duì)于采用CCD檢測(cè)系統(tǒng)而不是PMT或者其他檢測(cè)系統(tǒng)的熒光定量PCR儀器來說，由于曝光和成像原理，使得采集到的信號(hào)中間強(qiáng)，兩邊弱，即我們常說的邊緣效應(yīng)，因此對(duì)于此系統(tǒng)，將反應(yīng)管放在儀器中間是比較好的；
②對(duì)于采用熱蓋加熱或保溫的儀器，如果PCR管單獨(dú)放在儀器孔槽的一邊，容易讓熱蓋傾斜，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生細(xì)微的影響，因此放中間也好些。
leyu.樂魚篇
一、leyu.樂魚HBV一步法操作過程有什么需要注意的地方？
操作leyu.樂魚HBV一步法主要有如下需要注意的地方：
1.使用校準(zhǔn)過的移液槍，建議取核酸釋放劑和樣本的移液器量程最大為10ul，加反應(yīng)液的移液器量程最大為100ul。
2.加核酸釋放劑可以使用一個(gè)移液槍頭，建議采用深吸淺打的連續(xù)加樣方式（具體操作方式見后圖說明）。
3.標(biāo)準(zhǔn)品和樣本使用前先混勻并瞬時(shí)離心，加標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)候，加一個(gè)樣換一個(gè)槍頭，建議槍頭伸到底部吹打3次，力度均勻避免產(chǎn)生氣泡。
4.加完標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品并吹打三次后，建議等待10分鐘后再加反應(yīng)液，如一次做的標(biāo)本量在32個(gè)以上則不需要等待。
5.加反應(yīng)液的時(shí)候，加一個(gè)樣本換一個(gè)移液槍頭，避免污染！槍頭需伸入到八連管內(nèi)部靠壁加入，最好不要懸空加。
6.樣本和反應(yīng)液都可以采用淺吸深打的加樣方式（具體操作方式見后圖說明）。
7.加完反應(yīng)液后，無需等待，蓋上蓋子，即可上機(jī)。 移液器的兩個(gè)檔位：1檔、2檔 a.核酸釋放劑深吸淺打：調(diào)節(jié)移液器至5ul，吸液時(shí)按到2檔，伸入核酸釋放劑的試劑管中，松開移液器，即取到液體。將核酸釋放劑加入八連管中時(shí)，按到1檔打出去，此時(shí)打出去的液體剛好為5ul。手不要松開，此時(shí)槍頭中還剩下一部分液體，再將此槍頭伸入試劑管中松開，即第二次取液，按1檔將液體打入八連管，如此下去將核酸釋放劑均加入八連管。到最后一個(gè)孔時(shí)還剩余小部分核酸釋放劑，可以舍棄掉，如確定沒有被污染，可以打回試劑管中。 b.樣本和反應(yīng)液淺吸深打：即常規(guī)的加液方式，加樣本時(shí)，調(diào)節(jié)移液器至5ul（若是反應(yīng)液則是40ul），吸液時(shí)按到1檔，伸入試劑管中，松開移液器，取到液體。將試劑加入八連管中時(shí)，按到2檔完全將液體打出去。換一個(gè)槍頭加其他的樣本或試劑。
二、HBV一步法加5ul樣本是否太少了？
傳統(tǒng)的煮沸法過程是：取100ul血清樣本與100ul處理液A，經(jīng)高速離心、濃縮去上清后，加入25ul處理液B，最后取2μl DNA提取物上樣；通過反推法，煮沸法相當(dāng)于取了8μl原始樣本。我們綜合考慮煮沸法的提取過程，首先，在高速離心濃縮病毒時(shí)，對(duì)于高濃度的樣本，病毒沉淀不完全，容易造成第一次核酸丟失；其次，在去除上清液的過程中，因?yàn)槲覀儫o法清楚地看到離心管中的沉淀，槍頭極有可能碰到底部的病毒，導(dǎo)致帶出病毒，造成核酸的第二次丟失；再次，在高溫加熱煮沸過程中，蛋白質(zhì)高溫變性，成為凝膠狀，可能導(dǎo)致在第三步的高速離心中，凝膠狀的蛋白包裹核酸，沉降到離心管底部，造成核酸的第三次丟失。綜合可知：煮沸法的8ul上樣量是不準(zhǔn)確、不真實(shí)的。 反觀leyu.樂魚一步法，其原理是取5ul核酸釋放劑和5ul血清，直接加到PCR反應(yīng)管中，病毒裂解，核酸釋放出來。核酸釋放劑的裂解作用非常強(qiáng)烈，能夠使核酸完全釋放出來，核酸無需進(jìn)行提取，沒有損失，5ul血清中的病毒全部進(jìn)入擴(kuò)增，保證了定量的準(zhǔn)確性。
三、leyu.樂魚磁珠法的原理是什么？
leyu.樂魚磁珠法是采用納米磁珠提取血清或血漿樣品經(jīng)裂解后釋放出的的核酸，利用針對(duì)核酸保守區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物、一條特異熒光探針，配以PCR反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)核酸的定量檢測(cè)。簡(jiǎn)單步驟：加溶液1→加樣本→加溶液2→棄廢液→加溶液3和4→棄廢液→加反應(yīng)液上機(jī)。核酸提取溶液1含十二烷基硫酸鈉、曲拉通X-100、異硫氰酸胍等主要是裂解、釋放核酸的作用；核酸提取溶液2內(nèi)含磁珠顆粒，磁珠經(jīng)過特殊的修飾，能夠特異性吸附核酸。溶液3主要是無機(jī)溶液，主要是清洗吸附了核酸的磁珠，去除雜質(zhì)。溶液4為礦物油，能夠去除能溶于有機(jī)相的雜質(zhì)，同時(shí)，在去除廢液時(shí)，能更好的排除溶液3對(duì)擴(kuò)增的影響。
四、ROX校正有何作用？
通常我們?cè)谶M(jìn)行PCR的操作時(shí)，無法保證每個(gè)樣本的加樣量是完全一致的，每個(gè)樣本之間都會(huì)有細(xì)微的差別，同時(shí)，因?yàn)閮x器的溫控和光源系統(tǒng)都會(huì)存在不同程度的邊緣效應(yīng)，導(dǎo)致模塊的每個(gè)孔間都存在差異。反應(yīng)液中ROX的濃度是固定的，因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)，因此ROX可用于消除用槍操作誤差、耗材PCR反應(yīng)管的管蓋、管壁的厚度差異，同時(shí)可校正儀器的孔間溫差以及光源的邊緣效應(yīng)造成的光學(xué)誤差，減少孔間差異，提高數(shù)據(jù)重現(xiàn)性和精確度，使定量更準(zhǔn)確。